目的
レトロウイルスベクターをゲノムＤＮＡに挿入することで遺伝子の機能を不活性化すると共に、そのベクターの性質を利用してベクターが挿入された遺伝子を簡便に同定できるようにする。
効果
このベクターでは、ピューロマイシン耐性遺伝子はプロモーターを有していないため、目的細胞内で発現している遺伝子のみを解析することができる。そして、レトロウイルスベクターを用いることにより、挿入部位の遺伝子がその変異形質の原因であるか、迅速簡便に確認することが可能である。更にベクター内部の配列を用いることにより、容易に挿入部位を同定できる。
技術概要
（１）一対のｌｏｘＰ配列、並びにｌｏｘＰ配列にはさまれた、プロモーターを有さず、３’側にポリＡ付加シグナルが付加されたピューロマイシン耐性遺伝子、および、ピューロマイシン耐性遺伝子の下流に位置する、プロモーターを有し、３’側にポリＡ付加シグナルが付加された、β−ガラクトシダーゼとネオマイシン耐性タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を有するレトロウイルス産生用ベクターである。（２）ピューロマイシン耐性遺伝子の前にスプライスアクセプター部位−ＩＲＥＳが付加された、（１）のベクターである。（３）（１）または（２）のベクターを細胞に導入するステップ、ベクターが導入された細胞から表現型が変化した細胞を選択するステップ、及び表現型が変化した細胞において染色体上のベクターの挿入位置に存在する遺伝子を同定するステップ、を含む、表現型に関与する遺伝子の同定方法である。ベクターとそれが導入される前後の染色体上の遺伝子の模式図を示す。
改善効果１
このベクターはレトロウイルスベクターであるため、培養細胞のゲノムに効率よく挿入される。更に両端にｌｏｘＰ配列を持つため、変異細胞にＣｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅを一過性に発現させることで、このベクターをゲノムから切り出して排除することが可能であり、その結果、変異細胞の形質を復帰させることが非常に容易に行える。更に、ベクター内部の配列を利用してＲＴ−ＰＣＲやｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲを行うことにより、挿入された部位の同定を容易に行うことが出来る。
基本情報
開放特許情報
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